默瑞生物提供近Novoprotein近岸蛋白質(zhì)一系列mRNA體外合成酶及試劑，解決mRNA疫苗的關(guān)鍵痛點。所有產(chǎn)品均采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留及常見病原體污染，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程，保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。

　　產(chǎn)品特點：

　　*GMP級mRNA體外合成及修飾原料，animal-free，ampicillin-free

　　*產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制及配套文件體系，符合mRNA疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求

　　*經(jīng)過臨床使用驗證，單批次產(chǎn)能千萬人份，年產(chǎn)能50億人份

　　mRNA疫苗的成功需要保證mRNA的穩(wěn)定性和高效翻譯效率以及mRNA的大量生成。

　　1、生成模板-質(zhì)粒線性化 相關(guān)產(chǎn)品：Bsa I，GMP Grade(貨號：GMP-RE026)

　　此步將構(gòu)建好的質(zhì)粒酶切，處理成線性化雙鏈DNA模板，用于下一步mRNA合成。

　　限制性內(nèi)切酶Bsa I 特異性識別雙鏈DNA中位點并進(jìn)行酶切，可將模板質(zhì)粒酶切線性化，作為mRNA體外合成模板;

　　酶切位點：

　　產(chǎn)品特點：

　　強(qiáng)特異性

　　受CpG、Dcm甲基化影響，剪切阻斷

　　受EcoBI甲基化影響，剪切可能受影響

　　不受Dam甲基化影響

　　2、mRNA體外合成

　　此步以DNA為模板，在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

　　T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特異識別T7啟動子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA互補(bǔ)的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。

　　產(chǎn)品特點：

　　高度特異識別T7啟動子

　　20ul反應(yīng)體系，產(chǎn)量可達(dá)150ug

　　可對低至1ng模板進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄

　　合成長度可達(dá)15k

　　體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，Qsep1結(jié)果顯示，純度高，均一性好。

　　3、mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾：加帽加尾

　　此步對mRNA進(jìn)行修飾，合成功能完整的mRNA。

　　完整mRNA結(jié)構(gòu)

　　3.1、mRNA加帽(Cap0)   

　　此步與3.2同時進(jìn)行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結(jié)構(gòu)，再將Cap0轉(zhuǎn)化為Cap1結(jié)構(gòu)。

　　在真核生物中，轉(zhuǎn)錄后的mRNA必需經(jīng)過一系列修飾才能形成完整的結(jié)構(gòu)，即在5'端形成一個帽子結(jié)構(gòu)(Cap1)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。

　　Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)用于給體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA催化加上帽子結(jié)構(gòu)(Cap0)，顯著改善mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力，使mRNA可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白，避免核酸外切酶等的降解破壞。

　　mRNA的帽結(jié)構(gòu)是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結(jié)構(gòu)由相鄰的RNA鏈通過三種酶的依次反應(yīng)形成。進(jìn)一步形成cap-1結(jié)構(gòu)需要2-O甲基轉(zhuǎn)移酶(Cat. No: GMP-M072, Novoprotein)參與，該修飾可以降低RNA在體內(nèi)引起的細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。

　　產(chǎn)品特點：

　　高效完成mRNA加帽Cap0

　　提高mRNA的穩(wěn)定性，防止被RNA酶降解

　　提高mRNA的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量

　　3.2、mRNA加帽(Cap1)

　　此步與3.1同時進(jìn)行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結(jié)構(gòu)，再將Cap0轉(zhuǎn)化為Cap1結(jié)構(gòu)。

　　真核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。已知Cap1結(jié)構(gòu)存在于所有真核生物mRNA，在穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明，體外轉(zhuǎn)錄修飾得到的Cap1結(jié)構(gòu)mRNA更不容易被免疫系統(tǒng)的RNA感受器(RIG-I)識別，因此免疫刺激更低。

　　mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas (2´-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體， 在 RNA 5´末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)(Cap 0)的第一個核苷酸的 2´-O 上添加甲基基團(tuán)，形成帶有 Cap 1 結(jié)構(gòu)的 mRNA。Cap1 結(jié)構(gòu)能增強(qiáng) mRNA 的翻譯效率，從而可提高轉(zhuǎn)染后 mRNA 編碼的蛋白表達(dá)水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)(m7GpppN)的 RNA 為底物，不會作用于 5´末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)(m7GpppN)的 RNA 可通過 Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)來制備。

　　產(chǎn)品特點：

　　使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子

　　提高 RNA 的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量

　　進(jìn)一步降低免疫原性

　　完整mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對比

　　3.3、mRNA加尾(PolyA)

　　此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。

　　真核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。Poly A與成熟mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始以及出核運輸有關(guān)，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后修飾中，polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個A堿基。

　　體外轉(zhuǎn)錄RNA過程中，E. coli Poly (A) Polymerase(加尾酶) 不依賴模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3´末端，即在 RNA 的 3´末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3´末端加入 20~200 個 A 堿基。 還原體內(nèi)加尾過程。

　　產(chǎn)品特點：

　　穩(wěn)定mRNA的存在形式

　　引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止

　　提高RNA在真核細(xì)胞中的翻譯效率

　　4、其他相關(guān)產(chǎn)品

　　4.1、防止mRNA降解

　　在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。

　　RNase Inhibitor可與RNase A形成1：1復(fù)合體，對RNase 有*非競爭性抑制，保護(hù)mRNA轉(zhuǎn)錄后不被降解

　　產(chǎn)品特點：

　　強(qiáng)抑制RNase活性

　　穩(wěn)定性強(qiáng)

　　4.2、降解模板DNA

　　在流程2 RNA合成結(jié)束后，去除模板DNA。

　　DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機(jī)分解。

　　DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留

　　4.3、增加mRNA產(chǎn)量

　　在流程2 RNA合成過程中加入無機(jī)焦linsuan酶，增加RNA產(chǎn)量。

　　無機(jī)焦linsuan酶PPase(Pyrophosphatase, Inorganic)可催化無機(jī)焦linsuan鹽水解生成正linsuan鹽(P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2)，一方面可去除無機(jī)焦linsuan鹽對反應(yīng)體系的抑制，另一方面為反應(yīng)提供熱力學(xué)動力，促進(jìn)產(chǎn)物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質(zhì)的生物合成中，是一種良好的輔劑，在mRNA疫苗體外大規(guī)模合成中加入可顯著提高產(chǎn)量。

　　無機(jī)焦磷酸酶去除mRNA合成過程中產(chǎn)生的焦磷酸，提高mRNA產(chǎn)量

　　相關(guān)清單